精液的实验室诊断现状与研究进展

男性科学

 

  在十七世纪,Leeuwenhoek 对精子进行了首次描述,但直到 1928 年,精子计数才被认为与男性生育力相关。自此,各种精子试验及精液参数的研究开始逐步发展,以期能鉴别男性是否与具有生育能力。MacLeod (1942)、MacLeod 和 Gold (1953)、Eliasson (1971)及 Hellinga (1949,1976)等几位科学家建立的精子与精液传统分析基础理论与方法,至今,仍具有重要的参考价值,并且是许多新方法的重要参考指标。

  不育是一个世界性问题。20 世纪 90 年代联合国世界卫生组织(World Health organization, WHO)统计资料显示,全球约 15%育龄夫妇存在不育问题,其中,男性因素导致的不育占 15%,女性因素导致的不育占 30%,其余部分则是男女双方共同的因素和其它未确定因素所导致。我国同期统计资料显示,育龄夫妇不育的发生率约为 12.5%。此外,随着科技的飞速发展,全球污染问题的日益严重,人类的精子质量正悄然下降。在过去 50 年时间里,男性精子数量几乎减少了一半,并且,还以每年 2.1%的速度在减少,同时,畸形、劣质精子比例逐渐增多,精子活力、穿透力、致孕率在不断下降,以致使男性不育的比例也正在逐年上升。因此,随着社会的进步,医学的发展,人们对评价男性生育能力及精子质量的精液分析的实验诊断理论与技术提出了更高的要求。近年来,逐步发展起来的抗精子抗体检测、计算机辅助的精液分析、精液质量分析仪、流式细胞精液分析等在精液分析领域的应用,为全面、准确、快速、客观地评价精液质量提供了可靠的手段,广泛应用临床男性不育精子与精液质量评价,以及体内/体外人工授精、精子库、精子冷冻与保存等。

  第一节 精液分析现状

  一. 精液概述

  精液(semen)主要由精子(spermatozoa,sperm)和精浆(seminal plasma)两大部分组成,精子是男性的生殖细胞(germ cell);精浆是运送精子的载体,也是营养精子、激发精子活力的重要物质。精子是由睾丸产生,精浆则是男性副性腺(附睾、精囊、前列腺、尿道球腺和尿道旁腺)分泌的混合液。在精液中精子仅占很少的一部分,大部分都是精浆。因此睾丸、输精管道及附属性腺的结构和功能的损害或病变均可影响精液质量。而且人体是一个整体,除了全身性疾病会影响精液质量外,每一个体所处环境的改变、营养、有害物品接触、吸烟、饮酒,甚至精神情绪改变,都会引起精液质量的变化。正常人精液中的精囊液与前列腺液的比例为 2:1。精囊液偏碱,前列腺液偏酸,因而精液 pH 偏碱,一般为 7.2-8.0。精液的渗透压对精子的活力具有重要的影响作用,如渗透压过高时精子出现曲尾畸形。人类刚射出精液的渗透压远远低于生理盐水的渗透压,一般为生理盐水的 0.55-0.58。在正常情况下,附睾内的渗透压很高,精子在附睾的渗透压环境中失水,活力极低,代谢很慢,因而能够被保存。精子一旦离开附睾与精浆发生接触,立即进入低渗环境,从而吸收水分呈现激活状态。

  二. 精液分析标本的采集与运送

  精液标本的采集与运送是精液检查的一个重要步骤,采集与运送方法恰当与否将直接影响检查结果的准确程度。在采集精液标本前必须禁房事,禁欲时间最短不得少于 48 小时,最长不得超过 7 天。由于精子生成数目变化范围较大,且精液分析受多种因素(环境、温度等)的影响,因此不能单凭一次精液分析结果做出判断,一般应间隔 1-2 周进行 2-3 次复查。标本运送过程中本应当保存在适当的温度环境下(20-40℃),温度过高或过低都将影响精子活力(率)。精液标本应当在采集后于保温条件下(20-40℃)1 小时内送到实验室检验,液化后立即分析,或在射精后 1 小时内分析。如果未收集到射出的全部精液,特别是丢失了射精过程中的第一部分精液的标本,以及标本运送过程的时间过长(超过 2 小时)标本,均不能作精液分析。精液采集方法主要有手淫法和体外排精法。其中,手淫法最为理想,采精者可直接在实验室内进行,也可以让采集者在一个安静的房间由本人手淫将精液射人灭菌干燥容器内,在 30min 内送到化验室并注意保温。而体外排精法由于易漏掉精子密度最高的前段精,故不主张采用,仅适用于手淫或电按摩采集法不能采精的患者。

  三. 精液分析的目的

  就临床医师而言,精液分析的目的是观测生育力、鉴别不育原因或检测生育力的变化,他们所关心的是受精或避孕的对精液质量的最低标准。而就流行病学或毒理学家言,精液分析是评价工作场所、环境因素、药品、化学物质的危险因素的基础。对于整个社会而言,对人群生育力降低概率的判断远远重要于对个人生育力高低的准确评价。当然,精液分析的最终目的是要能够精确地预测或判断男性个体精液标本的生育力。

  但由于精液分析受多种因素的影响,要达到上述目标还比较困难。对生育力的精确预测或判断受限于精子本身的特征因素,以及受精过程与体外精液分析的方法等多种因素。而且,精子生育力还受限于精卵结合的方式,如是性交还是体外人工授精(in vitro Fertilization, IVF);精子状态,如是新鲜精子还是冻融精子;以及妇女因素,如女性的年龄、子宫或输卵管环境因素等。

  精液分析的结论有时比较明朗。当精液分析结果显示无精子、无快速前向运动精子或异常形态精子比例较高时,男性生育力可明确地判断为比较差。但在多数情况下,对于精液分析结果的判断需要一定的经验与技术。

  四. 精液分析的主要内容

  1. 精液常规分析

  精液常规分析(SFA 或 RSA)是评价男性生育力的传统方法,其主要检测内容包括精子密度、活率与活力、形态学的检查等。它可提供睾九精子发生及附睾精子成熟情况。据估计,SFA 评价生育力仅有 70%的准确性,即 SFA 与实际生育力之间不尽一致。除了无精子症或少、弱、畸形精子症外,精液常规分析并不能把有生育力和无生育力的病人完全区分开。但是,精确的 SFA 仍然是男性不育的重要检测手段。

  ①精液的理化特征

  精液是一种有一定粘稠度的半流动状液体。精液的颜色,难以作出确切的判断。一般认为,正常人刚射出的精液有强烈刺激的其味为石榴花的腥味,呈灰白或灰黄色,自行液化后则为半透明的乳白色或灰黄色。长时间未排精者射出的精液可略带淡黄色。老年男性精液呈暗黄色。精液量的主要组成部分是附属性腺的分泌物。正常人一次排出的精液量约 2-5ml,平均为 2.4±1.3ml,但精液量与射精频数有关。一定的精液量是保证精子活动的间质,并可中和阴道的酸性分泌物,保护精子的生命力,以利于精子通过子宫颈口。少于 1.5ml、大于 8.0ml 可视为异常。刚射出的精液呈稠厚的胶冻状,在前列腺分泌的蛋白酶的作用下,5min 后从凝固状态转变成流动状液体的过程,称之为精液液化(liquescence)。精液的暂时凝固及随后的液化属正常生理现象,与精襄腺分泌的凝固蛋白及前列腺分泌的液化因子有关。观察液化时间,标本应放在 37℃,每 10min 观察 1 次。正常人刚排出的精液有高度的粘稠性,镜下观察精子呈不活动状态。精液离体后 5-10min 开始液化,20-40min 完全液化,液化后可看到具有完全正常活力的精子。精液粘稠度测定对评价精浆质量提供了一个客观依据。粘稠度增高的临床意义与精液液化异常相同,并可反映前列腺因慢性炎症所造成的功能障碍。精液的 pH 值由来自前列腺的酸性分泌物及精襄的碱性分泌决定,正常范围为 7.2-8.0。精液 pH 值>8.0,常见于急性感染,应怀疑前列腺因炎症而导致酸分泌物的减少,如枸橼酸;精液 pH 值<7.0,多见于少精或无精症,常反映输精管道阻塞、先天性精囊发育不全或附睾病变。注意,在精液标本采集不完全的情况下,也应当完整地记录精液的 pH 值。

  ②精子密度/浓度及精子总数

  精子密度(sperm density)是指每毫升精液中的精子数目,也称精子计数(sperm count)和精子浓度(sperm concentration)。精子总数(total sperm cout)表示表示一次排精全部射出精液量中的精子总数目,即精子密度(106/ml)与精液量(ml)的乘积。由于正常人精子有较高的密度、活动度及精液有较强的粘稠性,计数前应进行适当的稀释,并杀死或抑制精子活动和降低精液的粘稠性。

  80 年代以前常采用计算血液白细胞方法,使用标准血细胞计数器来检验。将精液标本充分混匀后,按 1:20 比例稀释后,滴入血细胞计数盘内,于室温中静置 2-5min,使精子完全沉积,然后以高倍镜计数中央大方格内 5 个中方格的精子数,计数原则为“数上不数下,数左不数右”。5 个中方格的精子数乘以 106 即为每 ml 精液中的精子数。现在常采用 Makler 精子计数板、Microcell 精子计数池、计算机辅助精液分析(CASA)、精子质量分析仪(SQA)、精子图像分析仪等检测。

  精子总数可反映体内精子生成状态,并与禁欲时间长短有关。正常人精液精子密度变化很大。 Glezennan 和 Bartoou(1986 年)报道,正常精液的精子密度为(30-250)×109/L;国内江鱼报道为(10~130)×109/L;王信少(1989 年)等报道为(29-167×109/L)。 WHO 规定:精子密度致孕的低限为 20×109/L,一次排精总数少于 1×108 ( l 亿)/L 为不正常。目前公认,精子密度低于 20×109/L 为不正常,连续 3 次检查皆低下者可确定为少精症,精液中多次未查到精子为无精子症,主要见于睾丸生精功能低下,先天性输精管、精囊缺陷或输精管阻塞。但必须强调的是,精子数 20×109/L 的患者并非无生育力,有些的受孕需要较长时间而已。精索静脉曲张、铅等重金属有害工业污染、大剂量放射线及某些药物,均可引起精子减少。正常人从 50 岁开始精子数减少,以至逐步消失。

  ③精子活力与活率

  精子活力(motility)是指活动精子的运动能力,是测定精子活动能力的定性方法;精子活率(vitality)是指精子总数中活精子所占比例,是测定活精子和死精子的定量方法。精子活力与活率取决于有鞭毛运动精子的百分率。该检验要在射精后 2 小时内进行,精液标本应保持在 37℃。从完全液化并充分混匀的精液标本中取一滴(小于 10ul)新鲜精液滴于干净、标准的载玻片或专用于精液分析的计数板上,盖上盖玻片,室温(18-24℃)静置 lmin,在低倍显微镜下随机选择 10 个视野,观察精子活动状态,计算活动精子百分率。应当注意,检测用的精液量及盖玻片大小应当标准化,以保证分析时精液量的一致性(如 20ul)。盖玻片至玻片的高度应当使精子具有可充分旋转运动的空间。精子活力可受时间、温度、精液液化程度等的影响。因此,应当控制好室温,当温度范围超过 18-20℃时,精子动力会有部分改变,因此,实验室的室温应当标准化。精子的前向运动是其质量评估的关键。WHO(1994)将精液活力分为 4 个等级(表 1-1),国内习惯分为 5 个等级(表 1-2)。

  表 1-1 精子活动级别(WHO 1994)

级别 A B C D
精子运动状态 快速直线前向运动 慢速或无定向运动 非前向运动 不运动

  表 1-2 精子运动级别(国内)

级别 0 I
精子运动状态 不活动,无向前运动 活动不良,向前运动微弱,不呈直线运动,也不活泼 活动一般,有中等的向前运动 较好,有中速运动,但波形运动的较多 良好,为快速直线运动,很快超越一个视野,运动活泼

  精子活力检验除了显微镜检查外,还有连续摄影法和精子质量分析仪测定法。在用上述方法评价精子活率时,检测结果易受多种因素影响,如将在精液中不动的精子均判定为死精子。现主要采用精子体外活体染色技术定量测定精子活率。精子体外活体染色原理在于,精子染色与否与精子膜的损伤程度有关,死精子因其头部膜受损,色液可以渗透到细胞内而使细胞着色,而活精子则有完整的细胞膜,染色液不易渗入,精子不着色。常用的精子体外活华体染色技术主要有伊红 Y 或胎盼蓝法和苯胺黑伊红法。如果 0 级和 I 级精子在 40%以上,常为男性不育症的原因之一。精索静脉曲张者由于静脉回流不畅造成阴囊内温度过高和睾丸组织缺氧,可使精子活力降低。泌尿生殖系统的非特异性感染,如大肠埃希菌感染,以及某些抗代谢药、抗癌药、雌激素、氧化氮芥等,都可使精子活力下降。

  ④精子形态

  精子形态(mophorlogy)的检测对精母细胞和生育力是一个敏感的指标。正常形态精子似蝌蚪状,由头、体、尾三部分构成。头部略扁,呈卵圆形,顶体区清晰规则,占精子头部 40-70%,在精子头部前端呈透亮区;体部细长,不到头宽的 l/3,轮廓直而规则,与头纵轴成一直线;尾部细长,外观规则而不卷曲,一般长 50~60um。胞浆小滴(cytoplasma droplet)是精子的残存体,大小不超过精子头部 1/3,与头部相连。一些形态粗大的畸形精子在未染色的精液中通过亮视野显微镜检查就能明确。随着相差显微镜的使用,通过载玻片上湿的精液标本就可以获得细致的精子形态学检查。但是,最准确的检查需要将精液标本染色后显微镜观察。当精子计数<10×106/ml 时,应将精液 500rpm 离心 10min,取沉淀涂片;精子数>10×106/ml 时,直接取 l 滴精液涂片,空气中自然干燥。精液涂片染色方法很多,巴氏染色法是男科实验室中最常用的精子染色方法。其它常用的有 HE(苏木精-伊红)染色法或瑞-姬氏染色法,形态的特殊鉴别可用改良巴氏染色法,白细胞与生精细胞的鉴别可使用 WHO 推荐的正甲苯胺蓝过氧化物酶染色法。

  表 1-3 异常精子的种类与特征

精子部位 异常形态种类 形态特征
头部 大圆头 头部长>5.0um,宽>3.0um
  小圆头 头部长<4.0um,宽<2.5um
  尖头 头部长>7.0um,宽<3.0um
  梨形头 头部呈梨形
  无头 仅有体、尾部
  双头 2 个头,1 个体部和尾部
  无顶体 头部呈锅铲形,顶体部分或全部脱落
  混合畸形 上述 2 种以上头部畸形
体部 分枝 有分叉
  双体 2 个体部
  体部肿大 体部粗大,宽>2.0um
  缺如 无体部
  混合畸形 上述 2 种以上体部畸形
尾部 无尾 尾部缺失,只有精子头
  短尾 明显比正常形态精子尾部短
  双尾或多尾 2 个或多个尾部
  卷曲尾 尾部异常卷曲,可风尾与尖衔接
  曲尾 尾部呈 900 弯曲
  破尾 尾部某处畸表
  混合畸形 上述 2 种以上尾部畸形
其它 胞浆小滴异常 胞浆小滴大于正常精子头部的 1/3

  精子异常形态种类较多,但缺乏统一分类标准,各种畸形精子见表 1-3。正常精液中异常形态精子 10-15%,>20%为异常。精子畸变可出现在精子产生和附睾贮存过程中。未成熟精子增多与附睾功能障碍有关,或频繁射精也可造成。异常精子的形态常与感染、外伤、雄激素变化或化学药物及遗传因素影响有关。生殖系统的非特异性感染,可导致尖头和不定形头精子比例增多。精索静脉曲张由于静脉回流不畅造成阴囊内温度过高和睾丸组织缺氧,可引起精子头部或体部肿胀或缺陷,以及双头精子、胞浆小滴精子、卷尾精子的增多。服用激素或某些化学药品,精液中会出现不成熟的精子及其他生殖细胞和精子细胞体的胞质小滴。

  2.精子功能指标分析

  传统的精液分析检查主要包括精子密度、活力与活率、形态学指标,在一定程度上反映了男性的生育能力。但有时精液常规分析的结果的结果与实际生育力之间不尽一致。临床上常发现一些不育病人上述指标是正常的(排除女方因素),妻子不能怀孕,而精液常规分析精子密度低下者其妻子仍可怀孕的事实。有研究表明,精液常规分析与实际生育力的一致性仅有 70%。精子功能指标的测定,更能客观地反映精子的受精能力,是对精液常规分析的必要补充。精子功能测定主要有:①精子运动功能指标的测定;②精子穿卵试验;③精子-宫颈粘液的相互作用;④精子膜功能测定;⑤精子核功能测定;⑥精子线粒体功能测定;⑦精子顶体反应和顶体酶活力测定等。

  ⑴精子活力的测定及其运动特征的分析

  精子活动能力是精子受精的重要指标,因此,客观而准确地分析精子活力在男性不育的临床诊断中占有极为重要的地位。在我国,目前临床上仍推荐由训练有素的检验人员严格按照 WHO 编辑《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》进行精子活力及活力的测定。但这些测定往往带有一定的主观性、重复性差等不足。目前,已发展了一系列客观评价人类精子活力及其运动特征的新技术,如采用浊度分析法、激光散射测量仪、显微摄像术、连续分步曝光照相术、计算机辅助的精液分析(CASA)技术等。其中,以 CASA 技术受到普遍重视,它可以达到客观准确地量化分析精子运动轨迹,获得精子运动的多项参数。然而 CASA 系统受诸多因素影响,如测定精子浓度的准确性受精液中细胞成分和非精子的颗粒物质的干扰,测定活动精子百分率也受精液中非精子物质的干扰,以及由于不同厂家不同类型的 CASA 系统参数设置的差异而使彼此的检测结果无相比性,加上 CASA 所反映的是单个精子的运动参数,缺乏对精子群体的了解。因此,当前(1992)仍推荐以直接目测法来判断精子群体活力及其活动精子百分率,使用血球计数器来测定精子数。

  ⑵精子-宫颈粘液相互作用测定

  宫颈粘液是精子在受精过程中需穿越的第一道屏障。只有月经中期妇女的宫颈粘液才适合于精子的穿透。影响精子穿透宫颈粘液的因素包括宫颈粘液的理化状态、精浆酶的活性及精子运动的质量。

  精子和宫颈粘液相互作用试验分体内试验和体外试验。体内试验即性交后试验(post-coital test, PCT),体外试验主要包括玻片试验、毛细管试验和精子-宫颈粘液接触试验。PCT 结果取决于精子与宫颈粘液的相互作用,任何一方的异常均可影响 PCR 结果。因此,PCT 不仅能测定宫颈粘液中的活精子的数量,也可以了解性交后一定时间内精子在女性体内存活和运动情况。毛细管试验操作简便,实验条件易控制,影响因素少,特别是可以作用供者的宫颈粘液或宫颈粘液代用品,可方便地同时检测一批标本。此外,该试验还可以用来鉴别导致 PCT 结果异常的因素是在男方还是女方,具有很大的临床实用价值。影响毛细管试验的主要因素包括精子质量(精子活动力、形态正常精子百分率)、宫颈粘液的性状、试验时的温度、穿透时间及毛细管放置的位置。玻片试验的原理和作用类似毛细管穿透试验,区别在于此法在载玻片上直接观察精子对宫颈粘液的穿透,比毛细管法更为简便。

  ⑶精子顶体反应和顶体酶活力测定

  人类精子在离开男性生殖道时,还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程,才能获得受精能力,这一生理现象称为精子获能。人类精子顶体位于精子头前端,覆盖在精子核前面,由顶体帽和赤道板组成,是一个膜结合的帽状结构。顶体内含有多种蛋白水解酶和磷酸脂酶。获能的精子穿过卵丘细胞外基质时被激活引发顶体反应(acrosome reaction, AR)将顶体内的酶释放出来以溶解卵放射冠及透明带。精子只有在体内经过获能、顶体反应,才能穿入卵细胞与其融合,完成受精。因此,检测精子是否发生顶体反应有助于预测精子的受精能力。

  精子顶体酶是一种特殊的丝氨酸水解蛋白酶,它在引起精子顶体反应、精卵特异性结合、使精子穿过透明带等受精过程中起着关键作用。目前,对顶体酶在受精生物学和男性不育中的诊断价值越来越引起人们的重视。检测精子顶体酶的试验主要有凝集素免疫荧光染色法及考马斯亮蓝染色法。前者的检测原理主要是利用钙离子载体 A23187 诱导精子发生顶体反应,然后用能与精子顶体中含有的大量糖蛋白的糖基结合的豌豆凝集素(pisum sativum agglutinin, PSA)作为探针检测精子顶体反应。后者的检测原理也是利用钙离子载体 A23187 诱导精子发生顶体反应,发生顶体反应后的精子顶体丢失,顶体区不着色,顶体完整而被考马斯亮蓝染上紫蓝色的精子则为没有发生顶体反应的精子。精子顶体酶活力的测定可直接用明胶法测定精子顶体酶活性,其检测原理是精子在明胶制成的薄膜上孵育后,引起顶体的解聚,释放出顶体酶,将明胶溶解成亮环,酶活性的大小可依据亮环直径大小来判断。此外,顶体酶的活性还可通过检测酶活性可反映顶体酶全部活性的存在于精子顶体的精氨酸酰胺酶来确定。其原理是精氨酸酰胺酶以 Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺(BAPNA)为底物,分解产生有色产物——硝酰基苯胺,通过测定硝酰基苯胺的产量可推算出精氨酸酰胺酶的活性,从而反映顶体酶的全部活性。

  ⑷精卵相互作用的测定

  精卵细胞相互作用的评估是评价人类精子受精力最重要、最可靠的方法。临床上应用最广泛的精卵相互作用的试验是精子穿去透明带金黄仓鼠卵试验(sperm penetration of zona-free hamster egg assay, SPA),简称精子穿卵试验。SPA 是测定精子获能、顶体反应、卵膜融合能力以及精子核解聚能力的经典方法,国外已将其作为精子功能的常规检测方法。但由于此实验条件要求高,操作步骤多,技术要求高,国内仅限于研究机构用于研究目的,临床未作常规展开。在临床实践中,SPA 可用于以下几个方面:①对原因不明的不育者,检测其精子的功能;②在女方进行强有力的治疗,如促性腺激素治疗和输卵管成形术前,确定其丈夫精子的受精能力;③估计不育症病人精液异常程度的严重程度、观察治疗效果;④IVF-ET 时,估计供精者精液标本的质量和作受孕率的估计;⑤检测生殖抗体,如抗精子抗体对生殖的影响;⑥输精管结扎前,男性受精能力监测;⑦评价化疗或放疗对男性肿瘤病人生育力的影响;⑧估计化学药品、环境中的毒物和药物对人精子受精能力的影响。

  ⑸精子膜功能的测定

  在精子功能检测中,精子膜功能试验也引起人们的关注。精子膜上含有丰富的多聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分,精子膜的功能与精子获能、顶体反应及精卵融合密切相关。精子膜功能的测定,可预测精子的受精能力。

  反映精子膜结构完整性,常采用活体染色法(台盼兰或伊红 Y,死精子染色,活精子不染色);而反映精子膜生理功能的完整性则采用精子尾部低渗肿胀试验(hypo-osmotic swelling test, HOST)。其主要检测原理为:精子在低渗溶液中,必须重新建立内外液体间的平衡,水分子通过精子膜进入精子,使其精子体积增大而膨胀,这是活精子膜功能正常的标志,而膜功能不全(包括死精子)的精子表现为不膨胀。目前,对 HOST 的临床价值仍有争议,对是否能预测精子的受精能力有不同的看法,尚需积累更多的资料。

  ⑹精子核功能的测定

  精子核是精子重要的细胞器,饮食了父方遗传物质。精子发生过程中,各期生精细胞核内 DNA 的含量发生规律性变化,与核 DNA 结合的核蛋白也发生组型转换(即从组蛋白→过度蛋白→鱼精蛋白)。成熟的精子核内 DNA 与鱼精蛋白紧密结合,高度浓缩,抑制了基因的表达,使遗传物质保持稳定。精子核成熟度直接影响精子的受精能力和受精后原核的形成及胚胎的着床。目前,检测精子核功能的主要试验有精子核 DNA 荧光染色、精子核染色质抗解聚试验、苯胺蓝染色法检测精子核蛋白组型转换、精子核蛋白组分的测定等。

  ⑺精子线粒体功能的测定

  精子线粒体位于精子尾部的中段,形成线粒体鞘结构。哺乳类动物每个精子约含有 75 个线粒体。线粒体是精子运动能量提供的场所。线粒体鞘局部或完全缺失、线粒体的体积及分布异常,都可能使精子运动能力发生障碍而导致不育。在弱精子症和死精子症中,可见大量线粒体缺陷的存在。目前,检测线粒体功能的试验主要有硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium, NBT)法测定线粒体功能及精子线粒体 DNA 的测定。

  第二节 计算机辅助的精液分析

  传统的精液分析往往带有很大的主观性,由于检测手段、实验室条件、检验人员的水平与经验的不同,对精子运动能力的判断缺少严格的量化指标,造成了检验结果的差异,也降低了检验报告结果的客观性和可比性,给临床诊断和科研工作带来了一定的困难。分析的结果有时相差甚远。而利用 Makler 板(或 Macro 板)进行精子运动轨迹图像分析,计算精子的平均直线运动速度,操作流程多,工作量大。计算机辅助的精液分析(Computer Assisted Semen Analysis, CASA)是 80 年代发展起来的新技术,是一类计算机支持的精子运动测试系统。该测试系统是视频技术与计算机技术的高度结合,除可分析精子密度、活动百分率等精子参数指标外,更在客观地定量评价精子运动的速度及运动的方式与能力方面显示了其独特的优越性,大大克服了传统测定方法所存在的费时、信息量少、准确度差、主观性高等缺陷。80 年代后期建立的 CASA 技术主要是临床上用来评价人类精子的质量,为男性不育和人工授精提供诊断依据。近年来这项技术已被引用到男性生殖毒理学研究领域。

  一. CASA 系统中的主要参数术语

  下面列出了在 CASA 系统中分析精子运动能力的术语:

  ①轨迹速度(curvilinear velocity, VCL):也称曲线速度,即精子头部沿其实际行走曲线的运动速度。

  ②平均路径速度(average path velocity, VAP):精子头沿其空间平均轨迹的运动速度,这种平均轨迹是计算机将精子运动的实际轨迹平均后计算出来的,可因不同型号的仪器而有所改变。

  ③直线运动速度(straight-line velocity, VSL):也称前向运动速度,即精子头部直线移动距离的速度。

  ④直线性(linearity, LIN):也称线性度,即精子运动曲线的直线分离度,即 VSL/VCL。

  ⑤精子侧摆幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH):精子头实际运动轨迹对平均路径的侧摆幅度,可以是平均值,也可以是最大值。不同型号的 CASA 系统由于计算方法不一致,因此相互之间不可直接比较。

  ⑥前向性(straightness, STR):也称直线性,计算公式为 VSL/VAP,即精子运动平均路径的直线分离度。

  ⑦摆动性(WOB):精子头沿其实际运动轨迹的空间平均路径摆动的尺度,计算公式为 VAP/VCL。

  ⑧鞭打频率(beat cross frequency, BCF):也称摆动频率,即精子头部跨越其平均路径的频率。

  ⑨平均移动角度(MAD):精子头部沿其运动轨迹瞬间转折角度的时间平均值。

  ⑩运动精子密度:每 ml 精液中 VAP>0um/s 的精子数。

  图 1 CASA 系统参数术语示意图

  二. CASA 系统的基本组成

  ①相差显微镜、恒温装置和专用计数板(Makler 板、Macro 板或 Microcell 计数池等)组成摄像系统。

  ②高速、高分辨率的摄像机和电视监视器组成摄像系统

  ③计算机分析处理系统及打印输出系统。

  三. CASA 在精液分析中的应用价值

  CASA 是近十年来发展起来的新技术,现已逐步应用于男科实验室常规分析。CASA 的应用提高了男性不育实验室诊断、精子质量研究分析与评价的准确性与客观性,为人类不育提供了可靠的客观评价指标。CASA 具有的客观、高效、高精度的特点尤其能分析与精子运动功能相关的多种参数。

  CASA 系统与传统精液分析技术与方法相比,其主要进步在于 CASA 能更准确地确定精子浓度(计数)与运动特征。CASA 的一般工作流程为:通过计算机数字化影像设备“观察” 显微镜下精子;实验室技术人员“指导”计算机识别精子外观像什么及其是如何运动的;当计算机随后看到了在显微镜下的精子时,计算机可绘制出每个单个精子的数字影像或轨迹图,包括精子在显微镜视野范围内运动的速度和路径。通过此种分析方法,可以了解正常和异常精子的许多“微”特征。

  CASA 系统识别精子是根据人为设定的大小和灰度来判断的,准确性受精液中细胞成分和非细胞颗粒的影响。计算精子活动率时,精子只有产生了一定的位移,CASA 系统才认为是活动精子,而对原地摆动的精子则判断为不活动精子,测出的值低于实际结果。Davis 认为 CASA 系统参数的设置、阈值的设定、视屏取像率等都可以影响最终结果。CASA 对精子密度有一定的限制,在(20-50)×106/ml 范围内检测结果较理想。精子密度过高时,标本需要适当稀释,一般采用同份精浆标本稀释。精子密度过低时应多选几个视野采样。随着软件系统的不断改进,目前新的 CASA 系统可检测较大精子密度范围的精液标本。用于 CASA 系统的精子计数板有 Makler 板和 Microcell 计数池,Macro 计数板也可用于 CASA 系统,而 Microcell 可能更适用。

  由于 CASA 系统的设置缺乏统一的国际标准,不同厂商和型号的 CASA 系统分析结果可比性差,目前,WHO 并不推荐在精液常规分析中应用 CASA 技术,尤其是分析精子密度和活动率。但是,精液的自动化分析是今后发展的趋势,CASA 在分析精子运动功能指标方面尤其具有优势。目前,国内已有多家实验室引进 CASA 技术,国产的 CASA 系统也已进入临床应用。随着 CASA 本身系统的不断改进,其应用前景还是十分广阔的。

  四. CASA 系统仪器性能简介

  ㈠ WLJY-9000 型伟力彩色精子质量检测系统

  北京伟力技贸公司(http://www.wei-li.com/)研制的 WLJY-9000 型伟力彩色精子质量检测系统将现代化的计算机技术和先进和图像处理技术结合运用于精子质量的临床检验。它以 WHO 精液检验标准为依据,通过对精子动(静)态图像中精子运动特性的全面分析,既可定量分析精子总数、活动力、活动率,以可分析精子运动速度和运动轨迹,为临床提供有关精子质量的各项指标的准确数据,检测过程迅速,项目齐全,可为检验男性生育能力提供重要的科学依据。

  WLJY-9000 型 CASA 分析系统所检测的各项参数、运动速度和活力分级的直图以及精子运动轨迹图像等可选择打印输出,被检测对象的分析结果也可保存、备份和查询。该系统还可以将精子动、静太分析过程彩色图像即时输出,可供被检者本人观看或教学之用。此外,系统独有光路标定功能可自动修正光路系统误差,虚拟网络、区域放大等功能,增加了该系统的使用范围。而且系统能在多种显微镜物镜放大倍数下作用,并使系统操作更加灵活。

  1. 主要工作原理

  精子形态图像及精子运动图像衩 CCD 摄像头采集后,经视频输出口输入到监视器和计算机图像采集卡中,计算机相应的操作软件根据设定的精子大小和灰度、精子运动的移位及前述的精子运动有关参数,对采集到的图像进行动态分析处理;分析结果打印输出,同时也可将结果储存或将精子运动状态录制到录像带上,以供日后对比分析与研究之用.
  2.系统基本配置

  WLJY-9000 型伟力彩色精子质量检测系统及其系统构成示意图见图 2-3,其主要的基本配置如下:

  ①图像采集卡:PCI 高速彩色图像采集卡。

  ②计算机配置:Intel Pentium-Ⅱ 350M,4.3G 硬盘,32M 内存,35cm PHILIPS 彩色显示器。

  ③显微镜:三目生物显微镜。

  ④摄像机:Panasonic480 线 CCD 摄影头

  ⑤打印机:EPSON 440 彩色打印机。

  ⑥系统软件:WLJY-9000 最新版本软件包。

  ⑦操作系统:Windows95/98/2000。

  ⑧监视器:53cm 彩色电视机。

  ⑨录像机:Panasonic 录像机。

  ⑩视频分配器:单输入 4 输出。

  3.检测项目

  WLJY-9000 型伟力彩色精子质量检测系统多达 26 项,并可在检验报告单中提供精液的描述性特征,如清液颜色、精液量等,以及对精子活力的分级统计。

  表 1 WLJY-9000 型伟力彩色精子质量检测系统检验报告单内容

  精液特征

  禁欲天数(天)
  粘稠度
  精液量
  稀释比例

  酸碱度(pH)
  室温(℃)
  精液颜色
  液化时间(min)

  采精方式
  白细胞数(个)
  红细胞数(个)
  畸形精子数(个)

  检测项目(26 项)

  精子总数(个)
  活动精子数(个)
  曲线运动精子数(个)
  摆动性 WOB(%)

  精子密度(106//ml)
  活动精子密度(106/ml)
  直线速度 VSL(um/s)
  侧摆幅度 ALH(um)

  精子活率(%)
  活跃精子数(个)
  曲线速度 VCL(um/s)
  平均移动角度 MAD(度/秒)

  畸形率(%)
  活跃精子密度(106/ml)
  平均路径速度 VAP(um/s)
  鞭打频率 BCF(Hz)

  直线运动精子率(%)
  直线运动精子数(个)
  直线性 LIN(%)
  a 级精子 b 级精子

  精子直线运动率(%)
  直线运动精子密度(106/ml)
  前向性 STR(%)
  c 级精子 d 级精子

  精子活力统计分析

  a 级精子(快速前向运动)
  b 级精子(慢或呆滞的前向运动)

  c 级精子(非前向运动)
  d 级精子(不动)

  4.主要技术指标

  ①图像采集幅数(幅)················ 4-20

  ②每视场的采集分析时间(秒)············ <15

  ③检测速度的范围(um/s)·············· 0-180

  ④所选视场数(场)················· 1-20

  ⑤每场最多被测精子数(个)············· 1000

  ⑥适用显微镜物镜放大倍数·············· 10×、20×、250×、40×

  5.仪器主要特点

  ①彩色检测系统:使检测过程及报告打印更清晰、直观,经巴氏染色后可做精子畸形的分析观察,并为产品升级做形态学分析提供了必要条件。

  ②精子密度检验范围宽,标本不需要稀释:在强大的软件功能支持下,该系统在一个视野下可同时对上千个精子进行分析。精子密度在 0-300×106/ml 的精液标本均可被准确地检测而无需稀释,为临床检验提供了更大的便利。

  ③恒温操作台:恒温操作台确保整个检测过程中,精液标本温度恒定在 37℃,排除了外界温度过高或过低对精子速度、活力等检测指标的影响。

  ④系统标定功能:先进的系统标定功能可自动校准系统放大倍数,确保不同放大倍数下检测结果的一致性,并使该系统适应于多种放大倍数下的检测,增加了系统的灵活性、可适应性。

  ⑤虚拟网络功能:独特的虚拟网络功能实现了系统内的人、机检测结果的直接对照。

  ⑥数据库功能:强大的数据库功能可保存大量的病历和图像资料,为临床科学研究提供详细素材,并使计算分析过程在极短时间内完成。

  ㈡ ZKPACS-E 型精子质量检测分析系统

  ZKPACS-E 型精子(微生物)质量检测分析系统是由中科恒业公司(http://www.zkpacs.com.cn/)主持研发。该系统采用现代化的计算机技术与先进和图像处理技术,可对精子、血球、大肠杆菌等微生物的动静态特征进行全面的量化分析。特别适用于临床精液分析检验,能够极大的提高临床检测水平,广泛应用于医院的泌尿科、男性科、妇产(试管婴儿)科、计划生育、优生优育研究等。

  1. 主要工作原理

  ZKPACS-E 型精子质量检测分析系统是将精液标本通过显微镜进行放大,其图像经电文摄像系统送入计算机,运用先进和计算机技术对精子的密度、活力、活率、运动轨迹特征等进行自动化定质定量的检测分析。

  2. 系统基本配置

  ①计算机主机,奔腾 CPU 64M 内存 1000M 以上硬盘空间

  ②高档动态图像采集卡

  ③高清晰彩色显示器

  ④三目生物显微镜

  ⑤CCD 摄像机

  ⑥彩色打印机

  ⑦精子计数板

  ⑧恒温板 

  3.检测项目

  其检测项目分为两在类——计算机自动化检测项目及检验人员主观测试项目

  ①计算机自动化检测项目:共有 14 项,分别为曲线运动(包括平均曲线运动速度、曲线运动精子数、曲线运动活动精子总数、曲线运动精子活率)、直线运动(包括平均直线运动速度、直线运动精子总数、直线运动活动精子总数、直线运动精子活率)、平均路径运动(包括平均路径速度、平均路径精子总数、平均运动精子总数、平均运动精子活率)、精子运动速度分级统计(包括 A 级快速前向活率、B 级慢速前向活率、C 级非前向运动率、D 级极慢或不动率)、精子密度、精子侧摆动幅值、精子摆动性、精子鞭打频率、线速度、精子平均移动角度、直线运动精子数、直线运动率、精子总数、检测时间。

  ②检验人员主观检测项目:共 25 项,分别为精液其它成分(包括上皮细胞、红细胞、白细胞)畸形精子数(头部畸形精子数、尾部畸形精子数、体部精子畸形数、混合畸型精子数)、精子畸形率、精子外观、精液量、精子嗅味、精子 pH 值、禁欲时间、精子粘稠度、检测稀释比、取精日期与时间、病人的基本数。

  4. 系统的主要技术指标如下:

  ①样品的允许采集数量(个)··········1-600

  ②检测速度的范围(μm/s)·········· 0-180

  ③图像的采集幅数(数)·········· 0-30

  ④颗粒直径分辨率(μm)·········· 3-50

  ⑤采集分析的时间(分钟)··········1-5 或更长(与计算机内存大小有关)

  ⑥图像采集的组数(组)·········· 1-10

  5.系统的特色与创新之处

  ①系统设计过程中充分考虑基层临床的实际需要,构造结构简单合理,性能稳定,人机界面友好,操作直观、明快,使用者不需专门培训,即可掌握操作方法。

  ②彻底改变人工检测无量化标准,随意性大的缺点。使普通检验人员轻松掌握过去需要丰富的经验才能进行的检验技术,极大减轻了检验人员的知识压力。是检验手段划时代的变革。

  ③智能化程度高,自动检测、自动分析,自动定标功能保证在任何放大倍率下检测数据的准确。能够客观、准确、科学的提供全面分析精子质量检验数据。

  ④全面直观的数据图像检测分析,检测数据丰富,分析数据全面。可检测 34 项精液指标,三种速度分布统计图。

  ⑤检测速度快,检验分析瞬时完成。极大的减轻了工作人员的劳动强度,并且有效的减少了污染。

  ⑥可操作性强,同屏显示计数功能,即时显示检测数据,反复验证检测结果。

  ⑦直观、清晰、美观的打印报告报表设计,使诊断结果一目了然。

  ⑧提供数据库功能,检验结果保存在系统硬盘中。可以进行多样查询、修改、统计和打印检验报告的功能。为临床科学研究、教学提供了先进的手段。

  ⑨系统扩充功能强,通过简单的阈值设置即可应用于诸如血球、大肠杆菌等微生物特性的分析检测。也可应用在动物、畜牧等特殊行业的使用。

  ⑩通过 INTERNET 连接到http://www.zkpacs.com.cn/公司主页上进行系统的在线维护和软件升级。

  第三节 精子质量分析仪在精液分析中的应用

  精液分析对于男性不育在临床上的诊断、治疗及科研都是十分重要的检验项目,传统的精液分析主要依靠检验人员的主观判断及显微镜下操作,存在对检验结果缺乏客观而准确的评价。尽管二十世纪八十年代发展起来的 CASA 系统能快速、客观地分析精子的多种参数指标,但由于仪器价格昂贵,各生产厂商对各参数的设置与评价标准不同,且准确性和重复性不十分满意,难以广泛推广使用。精液质量分析仪(Sperm Quality Analyzer, SQA)是二十世纪九十年代发展起来的一种小巧便携、操作简便且价格低廉的新型仪器,通过显示精子活力指数(Sperm Motility Index, SMI)来反映精子的质量。目前,已有 30 多个国家和地区用于实验室诊断,国内也有部分单位在使用。

  一. SQA 工作原理

  利用光电原理,让光束通过具有一定厚度的微量体积的精液标本,将精子活动强弱和精子密度高低以光信号形式接收并处理,将其转换成电脉冲数字信号,经计算机处理后,以 SMI 值的高低对精子质量进行综合评价(图 1)。此外,SAQ 还可以给出功能精子浓度、总精子浓度、精子活动度及正常形态精子百分率等精液分析参数。

  二. SQA 系统的基本配置

  SQA 主要由特制毛细玻璃管载样系统、光信号检测系统、光电信号转换系统、输入输出终端(病人信息录入、结果显示与打印)、内部质控系统等几部分组成(图 1)。 

  三. SQA 系统常用参数定义

  1. 功能精子浓度(Functional Sperm Concentration, FCS):指同时具有快速前向运动及正常形态的精子数目,单位为 106/ml。

  2. 活动精子浓度(Motiles Sperm Concentration, MSC):指快速前向运动精子数目,单位为 106/ml。

  3. 精子活动指数(Sperm Motility Index, SMI):指在一秒钟时间内,毛细管载样池中的精子运动所产生的在光源路径上的编移数目与振幅,来自于反映浓度与平均前向运动速度相乘的精液参数。

  4. 总功能精子浓度(Total Functional Sperm Concentration, TFSC):指精液标本中功能精子的总数,以 FCS 与精液量的乘积表示。

  5. 总活动精子浓度(Total Motiles Sperm Concentration, TMSC):指精液标本中活动精子的总数,以以 MSC 与精液量的乘积表示。

  四. SQA 系统在精液分析中的应用

  SQA 检测系统通过可同时反映精子浓度(concentration)、活动力(motility)和活率(viability)等三项重要精液参数的 SMI 值达到对待检精子质量进行定量分析,目前已广泛地应用在临床男性生育力的评价,以及辅助生殖(Assisted Reproduction),包括子宫内授精(Intrauterine Insemination, IUI)、体外受精(in vitro Fertilization, IVF)、胞浆内精子注射(Intracytoplasma Sperm Injection, ICSI)等精子捐献者精子质量及体外精子分离技术(如 Percoll 密度梯度离心法)制备精子质量的综合评价等男性不育与人工受精的多个领域。

  1. SQA 检测系统特色精液参数 SMI 值

  SMI 值是 SQA 检测系统的特色精液参数,在定量评价精液质量应用方面具有重要的临床应用价值。SQA 利用光电原理,将精子浓度、活动力、活率通过一定的算法转换成可定量分析精子质量的 SMI 值。

  ①SMI 值与精子浓度、活动力、活率的相关性

  在 SQA 精子浓度、活率、活动力与 SMI 值相关性研究表明,当精子浓度达到一定值时,SMI 值最高,而当精子浓度高于或低于此值时,SMI 值均有所降低。当精子浓度(精子密度)过高时,由于精子在 SQA 毛细管载样池中不能自由运动,因而使 SMI 值降低。在精子浓度不变的情况下,SMI 值随着精子活率的降低而降低,因为随着精子活率的降低,能够通过 SQA 毛细管样器载样池光束的精子减少。在精子总浓度(精子总数)不变的情况下,SMI 值随活动精子浓度的增加而增加。此外,SMI 值与传统精液分析显微镜检测的精子活动力分级相关极为显著。

  ②SMI 值与传统精液分析方法(或 WHO 推荐标准方法)及 CASA 系统精液参数的相关性

  SMI 可同时反映活动精子浓度和活动精子密度,而通过传统精液分析方法则无法确定。精子密度(density)/浓度(concentration)、活动力(motility)、形态(morphology)是评价男性生育力的极为重要的三项精液参数,大部分研究结果表明 SMI 值与传统精液分析方法及 CASA 系统的精子密度、活动精子百分率、精子正常形态检测值相关性极为显著。SMI 值与其它精液参数的相关性研究表明,SMI 值与传统手工精液分析的正常顶体(normal acrosomes)及 CASA 系统的静止百分率(percent static)相关性极为显著,此外,CASA 检测结果中的 VCL、VSL、LIN 也与 SMI 值显著相关。多重回归分析结果显示,SMI 值显著相关变异量(the significant covariates of the SMI)为活动精子百分率、正常形态、ALH 和 VSL,上述参数与 SMI 值的 85.5%变异值(variance)相关。

  ③SMI 值与人工受精受精和/或受孕率的相关性

  在 SMI 值与人工受精(辅助生育)的受精和/或受孕率的相关性分析中,研究结果尚有争论。一部分研究者认为,SMI 值是人类精子的受精能力的一个观测指标。Johnston 的研究结果表明,IVF-ET 精子捐赠者新鲜精液 SMI 值与传统手工精液分析精子浓度、精子活动力、活动精子浓度相关性极为显著,精子穿透试验(Sperm Penetration Assay, SPA)检测的精子穿透指数(Sperm Penetration Index, SPI)值与 SMI 值的相关性也极为显著,且 SMI 与 IVF-ET 受精率的相关性明显高于 SPI 与 IVF-ET 之间的相关性,SMI 值愈高,则 IVF-ET 受精率就越高。但另一部分研究者认为,SMI 值不能预测人工受精(IUI、IVF、ICSI 等)的受精和/或受孕率,与其并无显著相关性,SQA 系统的应用并不比传统手工精液分析优越。在利用 Percoll 密度梯度离心法制备应用于辅助生殖所需精子的过程中,制备后的精子浓度,正常形态活动精子浓度和 SMI(制备前)可能是制备后 SMI 检测结果的独立决定因素。与制备前相比较,制备后的 SMI 值显著增高。研究结果提示 SAQ 能够对精子质量及精子制备技术(如 Percoll 密度梯度离心法)的效率进行快速评价。

  2. SQA 系统的其它精液参数

  部分研究表明,SQA 系统与传统手工精液分析方法(或 WHO 推荐标准方法)正常精子形态(normal sperm morphology)检测值在两种方法之间无显著相关性,而其它精液参数均比较一致,提示 SQA 系统是检测男性不育少精症(oligozoospermia)及精子活力不足症(asthenozoospermia)的好的筛选试验,但并不适合于评价精子形态。

  3. SQA 系统的优越性

  SQA 具有操作简便、客观性强、精密度较高、重复性较好等优点,能直观、客观、快速地评价精液的质量。但 SQA 仍有一定的局限性,并不能完全取代传统手工显微镜检验。在临床应用 SQA 系统对精液质量定量分析过程中,还应当结合显微镜检验,从而使检验结果更为准确与客观。

  五. SQAⅡC-P 型精液质量分析仪简介

  SQAⅡC-P 型是以色列医学电子系统有限公司(Medical Electronic Systems Ltd., MES; http://www.mes-ltd.com/)生产的最新型号的精液质量分析仪。MES 公司生产的 SQA 系统取得美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration , FDA)、ISO 9002 等国际权威机构认可,目前,在世界范围内的同类型检测仪达到的三千多台。

  1. 主要工作原理

  利用光电原理,将精液标本加入毛细管载样池后插入感光槽,然后光源束通过此感光槽。透过毛细管载样池的散射光被光信号接收器识别,光纤传导器将光信号传输至检测器,后者将光信号转变为电信号。此电信号经数字化处理后传输到内部计算机,后者应用一定的算法与规则将电信号转变为相应的精液参数。

  2. 系统主要组成

  ①显示面板 ②电源批示器

  ③光检测池 ④毛细管载样池

  ⑤键盘 ⑥参数设置

  ⑦打印机

  3. 检测项目

  ①仪器提供的 9 项精液参数:总精子浓度、活动精子百分率、正常形态精子百分率、功能精子百分率(FSC)、活动精子百分率(MSC)、精子活动指数(SMI)、标本精子总数、标本功能精子总数(TFSC)、标本活动精子总数(TMSC)。

  ②需操作人员录入的精液参数:禁欲时间、采集时间与日期、精液外观、精液量、精液酸碱度(pH 值)、液化时间、精液粘稠度、白细胞浓度。

  4. 检验结果分级标准

  表 1 SQAⅡC-P 检测结果分级表

  质量好 质量中等 质量差
SMI >160 80-160 <80
MSC >26 10-26 0-10
FSC >13 3-13 0-3
浓度 109/ml >30 20-60 0-20
形态(%) >30 20-30 0-20
活动力(% >30 30-50 0-30

  5. 仪器主要特色

  ①客观:操作自动化,精液参数全面。

  ②快速:所有结果的计算与显示仅需 45 秒。

  ③可靠:具有自动定标及自检系统,使仪器在检测过程中保持较高的客观性。

  ④操作简便:操作界面简便,人机对话快捷。

  ⑤检测灵敏度高:高灵敏检测的目的之一是确证男性避孕效果(特别是男性输精管切除术)。该检测模式下检测灵敏度可达 0.01×106/ml(在此浓度下,女性避孕效率为 98.5%),但耗时较长(420 秒),约是常规测试时间的 10 倍左右。该模式还可应用于对无精子症的诊断。

  第四节 抗精子抗体与男性不育

  不育不孕的原因是十分复杂的,免疫学因素的参与和某些不育不孕的发病有密切联系。早在 1899 年,Metchnikoff 及 Landsteinr 发现将异种动物精子注入机体可产生抗体。次年,Metchnikoff 证实了豚鼠在注射自体精子后,血液中有抗精子抗体(anti-semen antibodies, AsAb)的存在。在二十世纪五十年代,Wilwon 首先报道了在男性不育患者血清中发现 AsAb。90 年代 WHO 报道约有 3%不育患者为免疫因素引起的不育,其中,在 10%的不育男性血清和/或精浆中可发现抗精子抗体,在不育女妇女血清和/或宫颈粘液中也存在 AsAb。随着 AsAb 及其相关检测技术的研究进展,目前已能够准确地检测不育夫妇体内 AsAb,为不育的综合分析与辅助诊断提供了重要参考指标。随着体外受精技术(in-vitro fertilization, IVF)技术的发展,特别是胞浆内精子注射(intracytoplasmaic injection, ICSI)技术的提高,AsAb 所致不育的治疗有了突破性的进展。

  一. 人类精子抗原

  人类精子抗原相当复杂,约有 100 多种,按其细胞定位,可分为核抗原、胞浆抗原、膜固有抗原、包被抗原;按其特异性,可分为精子特异性抗原和精子非异性抗原。

  1. 精子特异性抗原

  受精抗原-1(fertiliztion antigen-1, FA-1),受精抗原-2(fertiliztion antigen-1, FA-2)/精子膜抗原、精子/滋养层交叉反应抗原(sperm/trophoblast cross-reaction antigen, STX-10)、乳酸脱氢酶-C4(LDH-C4)、胚细胞抗原(germ cell antigen-1, GA-1)、精子蛋白-10(sperm protein-10, SP-10)等。

  2. 非特异性精子抗原

  肌酸磷酸激酸(creatine phosphokinase, CPK)、甘露糖配体受体(mannose-ligand receptors, MLR)、C-myc 蛋白、C-ras 蛋白、G 蛋白、膜磷酸酷氨酸蛋白(membrane phosphotyrosine protein, MPP)。

  3. 其它精子抗原

  顶体素(acrosin)、ABO 血型抗原、HLA 抗原、鱼精蛋白(protamine)、精子膜抗原(sperm-coating antigens, SCA; 或 scafferrin)

  精子固有的细胞膜抗原由种属特异抗原、组织相容性抗原(HLA、H-y、F9)等构成。此外,精子的特异性酶是细胞膜上的乳酸脱氢酶(LDH-C4)和酶前体 acrosin(顶体蛋白),它们的相应抗体可引起受精障碍。

  二. 人类生殖系统免疫屏障

  在人类的整个生殖系统中,人体具有一套天然的免疫防御系统以避免 AsAb 的产生。目前研究认为,人类的生殖防御系统主要由以下两部分组成:

  1. 男性生殖系统血-睾屏障

  人类精子是在睾丸的曲细精管内产生的。曲细精管由界膜围绕,管壁上皮是由两类形态和功能不同的生精细胞和支持细胞组成。曲细精管界膜与支持细胞间紧密连接结构构成血-睾屏障。血睾屏障中,相邻的支持细胞基部牢固现时紧密地连接在一起,而相邻支持细胞外层的曲细精管界膜细胞膜在某些点上完全融合,具有紧密连接的典型结构。血睾屏障可防止精子与免疫系统接触,对在曲细精管内环境中合成的精子大分子抗原起到保护作用,在精子由输精管排出体外前后,淋巴细胞不能识别精子抗原,从而使机体不会将精子作为外来侵袭物而作出相应的反应而刺激淋巴细胞产生 AsAb。

  2. 男性精液中的免疫抑制物

  正常的男性精液中含有免疫抑制物质,如前列腺素和酸性磷酸酶等被统称为男性抑制物质(male inhibitory marterial, MIM)。在射精过程中,MIM 随精子一道进入女性生殖道,对局部和全身的免疫应答作用起到抑制作用,使精子及受精卵免遭免疫系统的排斥,同时可保障受精卵的着床发育。

  三. 抗精子抗体产生原因与机制

  由于人体具有完整的血-睾屏障、生殖系统屏障的保护作用及精液中 MIM 的存在,使各级生精细胞处在一个与免疫系统完全隔绝的环境中,所以,精子机体的免疫系统而言是一种“异物”,在功能上是一种自身隐蔽抗原,无论对男性自身还是女性都是外来抗原,具有抗原性。正常情况下,精子由于受到各种免疫屏障及 MIM 的保护作用,精子抗原不会引发任何机体免疫防御反应,因此,也就不会产生 AsAb。但一旦人体由于受到外界各种理化因素和/或疾病的影响,使人体的血-睾屏障或生殖道屏障遭到破坏或作用减弱,或产生抗 MIM 抗体,使精子抗原暴露在机体免疫系统中,即可激发机体对精子抗原的免疫防御反应而产生 AsAb。

  1. 血-睾屏障或生殖道屏障的损伤

  任何理化因素(各种化学物质、超声波、紫外线、射线等)或感染因素(细菌、病毒等感染)造成血-睾屏障以及生殖道免疫屏障的损伤均可引起抗精子抗体的形成。临床上常见的病因有:输精管结扎术、输精管吻合术、输精管梗组、精索静脉曲张、生殖道损伤、生殖道感染、睾丸损伤、隐睾症、曾接受精索附近的手术(如疝气甚至阑尾切除)等。以上原因可造成精子抗原或精浆抗原在生殖道中的通透性增加,或由于局部淋巴结传递抗原信息而发生免疫应签,或由于进入全身循环而产生体液和细胞免疫。

  2. 精浆中免疫抑制物失效

  在某些情况下,如生殖道感染、创伤和梗阻等可诱发机体产生抗 MIM 抗体。

  AsAb 主要有三种,即 IgA、IgG、IgM,均存在于男女双方的血液和生殖道分泌物中。以 IgM 与生育力降低关系最为密切。男性体液中的 IgA 和 IgG 可以与整个精子结合,女性体液中的 IgA 和 IgG 主要与精子头结合,而男女体液中的 IgM 主要与精子尾部结合。

  四. 抗精子抗体引起不育的机制

  抗精子抗体减弱生育能力,主要是通过精子制动、精子凝集及精子死亡等作用。AsAb 对整个生育过程中各个环节的影响大致有以下几种:

  1. 阻止精子穿过宫颈粘膜,干扰精子获能,使精子的运动能力和受精能力下降

  精子的获能部位是在女性的子宫和输卵管。精子只有经过获能才能完成受精。获能的本质是在于暴露精子表面与卵子识别位点,解除对精子顶体反应的抑制,从而使精子得以与卵子识别并穿入卵内完成受精作用。男性产生的 AsAb 自身抗体粘附于精子表面,使精子与精子之间发生凝集,从而影响精子的运动能力。在女性宫颈粘液中,与 AsAb 结合的精子的穿透和存活能力受损。因此,射出精液中被 AsAb 包被的精子越多,进入宫颈粘液和女性生殖道的精子就越少。精子抗体可引起精子凝集成团,其凝集方式主要有头-头、尾-尾、尾尖-尾尖、头-尾及混合型等五种形式。凝集在一起的精子机械阻碍使个别精子活动大受影响。精子抗体还有细胞毒作用,当精浆中补体活性较高时,还会引起补体介导的攻击反应,使精子死亡或不动。此外,对精子的代谢及精子收缩蛋白功能也有影响。

  2. 影响精子酶的活力,抑制卵母细胞的透明带和放射冠的分散作用

  精子透明质酸酶可使卵丘(放射冠)分散。而 AsAb 可通过抑制透明质酸酶的活力而抑制卵丘分散。

  3. 干扰精子顶体反应

  精子在女性生殖道获能后发生顶体反应,释放顶体内含物如顶体蛋白酶,此酶能促进精子穿过透明带和促进精卵结合。AsAb 能抑制此酶的活性,从而抑制顶体反应的发生。

  4. 封闭顶体膜上的抗原位点,抑制精子对透明带的附着与穿透,使精子不能穿过透明带。

  5. 影响精子与卵子的结合,干扰受精卵发育

  AsAb 能阻止精子与卵膜融合,导致不育。受精时顶体反应的精子赤道区是来源于两个配子的质膜的嵌合,AsAb 能与受精时转移到卵膜的精子抗原发生反应,干扰受精卵的发育。

  6. 影响胚胎的发育

  AsAb 可作用于受精后的胚胎,其原因可能是:早期胚胎在其发育过程中可暂获得各种抗原,称为时相特异性抗原或阶段特异性抗原,其中某些抗原与精子蛋白及畸胎瘤有交叉免疫性,在这种情况下,AsAb 易使怀孕妇女发生流产、胚胎吸收或死亡。

  五. 抗精子抗体的检测

  鉴于 AsAb 对生育的影响,目前医学家们建立了各种检测技术,以早期明确诊断出体内的抗精子抗体,以及时作出相应的诊疗。AsAb 的筛选试验应当使用新鲜的精液标本,并且推荐使用免疫珠法或混合抗球蛋白试验(亦叫混合细胞凝集反应或混合凝集反应)作为免疫性不育男性患者 AsAb 的过筛检测试验项目。

  1. 免疫珠试验(Immunobead Test,IBT)

  主要检测原理 免疫珠是可与兔(/羊)抗人免疫球蛋白共价结合的一类聚丙烯酰胺珠。通过观察精子表面 AsAb 与兔(/羊)抗人免疫球蛋白(如羊抗人 IgG、IgA、IgM)包被免疫珠吸附现象,可同时检测精子表面的 IgG、IgA、IgM 类别的 AsAb。此法既可检测可与精子表面结合的 AsAb,以可待测血清或宫颈粘液中的 AsAb。本法还能确定 AsAb 结合部位。

  主要方法步骤 ①直接法(Jones 法)——新鲜待测精液 1 滴,一式 3 份,分别加 1 滴最适稀释度的羊抗人 IgG、IgA、IgM 包被的免疫珠悬液,混匀加盖玻片;置湿盒 1 小时,普通光学显微镜下观察。②间接法——检测待测精浆或血清、宫颈粘液中免疫球蛋白(Ig)各类别的 AsAb。操作方法同混合细胞凝集试验间接法。

  检测结果判断 标准一——如果每高倍镜下可见免疫珠粘附到 2-3 个以上能动的精子,试验结果为阳性;标准二——≥25%的可动精子吸附到免疫珠上,试验结果为阳性。

  2. 混合抗球蛋白试验(Mixed Antiglobulin Reaction test, MAR test)

  主要检测原理 将新鲜、未经处理的精液与包被了人 IgG 的乳胶颗粒或绵羊 RBC 充分混匀,然后在上述混合物中加入单特异性抗人 IgG 抗血清,如果乳胶颗粒(或绵羊 RBC)与可动精子形成混合凝集物,则提示待测精液中存在 IgG 类别的 AsAb。

  检测方法步骤 ①直接法——首先制备致敏红细胞(人 IgG 包被的 O 型人红细胞或绵羊红细胞);然后取玻片 1 张,依次滴加新鲜液化待检精液 1 滴,羊抗人 IgG 血清 1 滴、4%致敏红细胞 1 滴,充分混匀,盖上玻片,用光学显微镜(400×)观察结果。②间接法——首先制备精子密度为 6×107/ml 的生育男性精子悬液,然后取 50ul 此精子悬液加入 50ul 待测血清,37℃水浴 1 小时后,再用 Baker 绶冲液洗 2 次;将此吸附有待测患者血清中 AsAb 的正常生育男性的精子悬液按照直接法继续操作。

  检测结果判断 ①直接法——标准一:致敏红细胞表面吸附 3 条以上精子,形成可动的细胞集团,试验结果为阳性;强阳性者几乎看不到自由活动的精子;标准二:≥50%的可动精子吸附致敏红细胞为阳性,10-50%的可动精子吸附致敏红细胞为可疑。②间接法——精子与致敏红细胞结合形成可动的混合集团为阳性,强阳性者几乎看不到自由活动的精子。阴性结果无混合凝集团可见,红细胞可凝集,但精子则自由游动。

  目前,其它常用的测定 AsAb 的免疫技术与方法主要有以下几种:

  1. 精子凝集试验(SAT)

  原理 生殖道分泌物、血清中存在 AsAb,其抗原位点在一定条件下能与精子膜固有抗原或来自精浆中的精子包被抗原发生免疫反应,从而出现凝集。主要有五种方法:

  1.1 试管-玻片凝集试验(TSAT)

  主要操作步骤 各取 0.1ml 夫妇双方血清 56℃灭活后,加 pH7.4 磷酸盐缓冲液(PHS)0.2ml 混匀后,再加自行液化后经 PBS 洗涤、分散后制备成的精子密度为 5×107/ml 精子悬液 0.1ml;阴性对照管取精子悬液 0.1ml,加 PBS 0.3ml。37℃水浴 1 小时,轻轻混匀、滴片,加盖玻片镜检。可检测 IgG、IgM 抗体类型

  结果 出现 3 条以上精子头-头、尾-尾、尾尖-尾尖、头-尾及混合型等五种结合即为凝集。观察 10 个视野(400×)有 5 个视野以下出现凝集即为阳性。

  1.2 明胶凝集试验(GAT)

  可检测 IgG、IgM 抗体类型,但敏感度低于 TSAT 法。

  1.3 浅盘凝集试验(TAT)

  本法敏感度高,精液用量少。

  主要操作步骤 选用精子活率>70%的生育男性精液,用 0.01m0l/L pH7.4 PBS 调整精子密度成 5×107/ml 的精子悬液;待检血清用 0.01m0l/L pH7.4 PBS 作 1:4、1:8、1:16、1:32 稀释;将浸泡在无水乙醇中的浅盘(6×3 个小室)取出,棉布擦干,加液体石蜡 50ul 覆盖每个小室,再分别取稀释的血清 5ul 和精子悬液 1ul 通过石蜡层注入小室。室温 18-25℃放置 3-4 小时,观察结果。

  结果 用倒置显微镜(400×)观察每个小室的凝集情况。

  1.4 明胶凝集试验

  1.5 组织配型板凝集试验

  1.6 毛细管凝集试验

  2. 精子制动试验(SIT)/补体依赖法

  主要检测原理 抗体分子与精子表面抗原相互作用,激活补体系统,导致精子顶体破坏,精子细胞膜通透性、完整性均受损,进而使精子失去活力。可检测 IgG、IgM 抗体类型,结果可靠,特异性强。

  主要方法步骤 取生育男性新鲜精液(精子活动率>70%),液化后用 PBS 洗涤精子,制备成 5×107/ml 的精子悬液;混合 3-5 只豚鼠新鲜血液,分装安瓿,作为补体来源;AsAb 阳性病人血清或兔抗人精子血清(RAHS),工作浓度经过预试验选定(选取在补体存在下能使 90%左右精子制动的稀释度);正常人血清(NHS)56℃灭活 30min,作为无制动活性的阴性对照;不育夫妇待检血清 56℃灭活 30min;检测管分为 5 管——依赖补体制动抗体检测管、不依赖补体制动抗体检测管、等渗盐水对照管、阴性对照管、阳性对照管。

  试验结果评价 每管取 1 滴混合液于载玻片上,用光学显微镜(400×)观察 10 个视野,计数 200 条精子中活动精子,算出精子活率。按下式得出精子制动抗体值(sperm immunolizing value, SIV):SIV=[阴性对照中精子活率%]/检测管中精子活率%。以 SIV≥2.0 为精子制动抗体阳性。

  3. 精子细胞毒试验(伊红-Y 染色法)

  主要检测原理 AsAb 在补体参下可导致精子制动与死亡。死精子可被伊红-Y 活体染料染色,由此可确定待检标本中有无 AsAb。

  主要方法步骤 取生育男性新鲜精液(精子活动率>70%),液化后用 PBS 洗涤精子,制备成 5×107/ml 的精子悬液;将上述精子悬液 16ul 分注于载玻片漆孔(2 个测定孔,2 个对照孔)内;测定孔中各加不育夫妇待测血清 20ul,再加入新鲜人 AB 型血清(补体来源)4ul;对照孔不加 AB 型血清;37℃水浴 30min 后,每孔各加 50g/L 伊红-Y 4ul,加盖继续温浴 2min 后,高倍显微镜下观察。

  试验结果评价 活精子不着色,死精子染成红色。计数 200 条精子中死精子百分率,计算杀精子抗体百分率(测定孔死亡精子百分率-对照孔死亡精子百分率)。正常夫妇杀精子抗体百分率≤9%,以≥10%为阳性。

  4. 间接免疫荧光试验

  4.1 抗精子膜抗体的检测

  主要试验原理 将未知抗体和已知抗原作用,温育后洗去未结合抗体。如果待检标本中含有 AsAb,即与精子抗原结合,然后再与标记有荧光素的抗球蛋白抗体作用,使抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生结合,从而使精子膜呈现荧光,由此得知待检标本中是否含有 AsAb。

  此法可观察精子不同染色类型,检出的抗体以 IgG、IgM 为主。

  4.2 抗精子核抗体的检测

  主要检测原理 精子经二硫苏糖醇皮质及胰蛋白酶处理后,使其头部肿胀、DNA 及核蛋白得以暴露,可与待检标本中相应抗体结合,经与荧光标记的第二抗体相互作用,从而使精子核呈现荧光。

  本法可检出抗精子抗原决定簇抗体,特异性较强,往往与精子凝集、制动试验结果一致。

  5. 间接血凝试验

  主要检测原理 将精子抗原吸附于 RBC 表面,使之致敏,然后与 AsAb 特异性结合,在有电解质存在的环境下,致敏 RBC 可发生特异性凝集反应。

  本法应与明胶凝集法、玻片凝集法、制动法敏感,与免疫荧光法、免疫酶组化法一致。适用于原因不明的不育患者 AsAb 检测。

  6. 酶联免疫吸附试验(ELISA)

  主要检测原理 将精子膜抗原吸附到聚苯乙烯固相载体上,其固相抗原可与待检标本中的 AsAb 结合,并与加入的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人 IgG(HRP-羊抗人 IgG)结合起反应,形成“抗原-抗体-酶标记二抗”结合物,最终在酶底物作用下显色。

  主要方法步骤 人精子膜抗原制备——取 20 份正常生育男性精液,液化后,用 PBS 洗涤后,将沉淀的精子混悬于 0.5% NP-40Tris-HCl 缓冲液,离心后,其上清液蛋白即为精子膜抗原。

  检测结果判断 精浆和宫颈粘液中的 AsAb 主要为 AsAb-IgG 和 AsAb-IgA 类别,建议同时检测这 2 种类别 AsAb。加终止液后,450nm 吸光度值 P/N≥2.1 为阳性;也可不加终止液,通过与阳性对照而直接用肉眼判断。

  7. 酶免疫斑点试验

  主要检测原理 将滤纸或纤维素膜作为固相载体交联可吸附抗原后,再分别与未知抗体和酶标记第二抗体反应。经酶催化底物而显色,从而检测相应抗体。

  8. 生物素-亲和素酶联吸附试验(BA-ELISA)

  主要检测原理 待检抗体与固相抗原反应后,再加入生物素化第二抗体,形成抗原-抗体-生物素化第二抗体复合物,然后与酶标亲和素作用,并通过底物而显色。

  9. 生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA)

  主要检测原理 将精子与待检抗体作用,再与生物素化第二抗体结合形成抗原-抗体反应体系,再加入预选使亲和素与酶标记生物素按一定比例共温形成的亲和素-生物素-过氧化酶复合物(ABC),使之与生物素化抗抗体作用,此时,ABC 中尚未饱和的亲和素结合部位可与抗抗体分子上生物素结合,从而形成 ABC 标记体系,最后通过底特显色。

  本法相当敏感,适用于检测微量抗体。

  10 免疫洗涤法

  主要检测原理 待检标本中 AsAb 与精子表面抗原结合后,再与固相载体上的抗 IgG 作用,使精子附着于固相载体上。

  此法具有较高的敏感性和特异性

  11. 固相酶联染色法

  主要检测原理 待检标本中 AsAb 能与固相化精子抗原特异性结合,然后与加入的酶标记抗人 IgG 发生免疫反应,所加底物被酶转化为有色产物,使 AsAb 得以检出。

  12. ABC 免疫组化法

  主要检测原理 精子经固定后与待检抗体(第一抗体)作用,然后加入生物素化羊抗人 IgG(第二抗体),经与 ABC 复合物反应,最后在底物中显色。

  13. 放射免疫测定法(RIA)

  主要检测原理 将 I123 标记的人精子膜蛋白分别与待检标本及兔抗人精子血清混合作用一定时间后,以羊抗兔 IgG 第二抗体作为分离剂,离心分离精子抗原-抗体-第二抗体复合物,测定总放射性 T 及复合物的放射性 B,以各标准管的结合率(B/T)为纵坐标,其各浓度为横坐标,绘制标准曲线,根据待检标本中复合物中的 B/T,即可知 AsAb 含量。本法可对待检 AsAb 定量。

  14. 免疫印迹法

  主要检测原理 将粗提人精子膜抗原进行 SDS-PAGE 电泳,然后将膜抗原从凝胶上转移到醋酸纤维膜上进行转移电泳,在电场作用下,蛋白质进入醋酸纤维素薄膜而固相化,随后与待检标本(第一抗体)温育,再与结合有辣根过氧化酶的兔抗人 IgG(第二抗体)温育洗涤后,加入酶底物显色处理,其醋纤膜经扫描分析,即可检测 AsAb 量。

  本法可检出微量可极微量低效价 AsAb,尤其适合体外授精系统检测 AsAb 量,并可分析 AsAb 在精卵结合中的生物学活性,有助于从分子水平研究免疫不育机理。



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