男性精液的实验室诊断与技术

男性科学

随着科技的飞速发展,全球污染问题的日益严重,人类的精子质量正在悄然的下降。在过去的 50 年时间里,男性精子数量几乎减少了一半,并且,还以每年 2.1%的速度在减少。同时,畸形、劣质精子比例逐渐增多,精子活力、穿透力、致孕率在不断下降,以致使男性不育的比例也正在逐年上升。因此,随着社会的进步,医学的发展,人们对评价男性生育能力及精子质量的精液分析的实验诊断理论与技术提出了更高的要求。

近年来,逐步发展起来的抗精子抗体检测、计算机辅助的精液分析、精液质量分析仪、流式细胞精液分析等在精液分析领域的应用,为全面、准确、快速、客观地评价精液质量提供了可*的手段,广泛应用临床男性不育精子与精液质量评价,以及体内/体外人工授精、精子库、精子冷冻与保存等。

一. 精液概述

精液:主要由精子和精浆两大部分组成,精子是男性的生殖细胞。
精浆:是运送精子的载体,也是营养精子、激发精子活力的重要物质。
精子:是由睾丸产生,精浆则是男性副性腺(附睾、精囊、前列腺、尿道球腺和尿道旁腺)分泌的混合液。
在精液中精子仅占很少的一部分,大部分都是精浆。

因此睾丸、输精管道及附属性腺的结构和功能的损害或病变均可影响精液质量。而且人体是一个整体,除了全身性疾病会影响精液质量外,每一个体所处环境的改变、营养、有害物品接触、吸烟、饮酒,甚至精神情绪改变,都会引起精液质量的变化。

正常人精液中的精囊液与前列腺液的比例为 2:1。精囊液偏碱,前列腺液偏酸,因而精液 pH 偏碱,一般为 7.2-8.0。精液的渗透压对精子的活力具有重要的影响作用,如渗透压过高时精子出现曲尾畸形。人类刚射出精液的渗透压远远低于生理盐水的渗透压,一般为生理盐水的 0.55-0.58。在正常情况下,附睾内的渗透压很高,精子在附睾的渗透压环境中失水,活力极低,代谢很慢,因而能够被保存。精子一旦离开附睾与精浆发生接触,立即进入低渗环境,从而吸收水分呈现激活状态。

二. 精液分析标本的采集与运送

精液标本的采集与运送是精液检查的一个重要步骤,采集与运送方法恰当与否将直接影响检查结果的准确程度。

在采集精液标本前必须禁房事,禁欲时间最短不得少于 48 小时,最长不得超过 7 天。由于精子生成数目变化范围较大,且精液分析受多种因素(环境、温度等)的影响,因此不能单凭一次精液分析结果做出判断,一般应间隔 1-2 周进行 2-3 次复查。

标本运送过程中本应当保存在适当的温度环境下(20-40℃),温度过高或过低都将影响精子活力(率)。精液标本应当在采集后于保温条件下(20-40℃)1 小时内送到实验室检验,液化后立即分析,或在射精后 1 小时内分析。如果未收集到射出的全部精液,特别是丢失了射精过程中的第一部分精液的标本,以及标本运送过程的时间过长(超过 2 小时)标本,均不能作精液分析。

精液采集方法主要有手淫法和体外排精法。其中,手淫法最为理想,采精者可直接在实验室内进行,也可以让采集者在一个安静的房间由本人手淫将精液射人灭菌干燥容器内,在 30min 内送到化验室并注意保温。而体外排精法由于易漏掉精子密度最高的前段精,故不主张采用,仅适用于手淫或电按摩采集法不能采精的患者。

三. 精液分析的目的

精液分析的目的是观测生育力、鉴别不育原因或检测生育力的变化。由于精液分析受多种因素的影响,对生育力的精确预测或判断受限于精子本身的特征因素,以及受精过程与体外精液分析的方法等多种因素。

精子生育力还受限于:a,精卵结合的方式,如是性交还是体外人工授精(IVF);b,精子状态,如是新鲜精子还是冻融精子;c,以及妇女因素,如女性的年龄、子宫或输卵管环境因素等。

精液分析的结论有时比较明朗。当精液分析结果显示无精子、无快速前向运动精子或异常形态精子比例较高时,男性生育力可明确地判断为比较差。但在多数情况下,对于精液分析结果的判断需要一定的经验与技术。

四. 精液分析的主要内容

1. 精液常规分析

精液常规分析(SFA 或 RSA):是评价男性生育力的传统方法,其主要检测内容包括精子密度、活率与活力、形态学的检查等。它可提供睾九精子发生及附睾精子成熟情况。据估计,SFA 评价生育力仅有 70%的准确性,即 SFA 与实际生育力之间不尽一致。除了无精子症或少、弱、畸形精子症外,精液常规分析并不能把有生育力和无生育力的病人完全区分开。但是,精确的 SFA 仍然是男性不育的重要检测手段。

①精液的理化特征
精液:是一种有一定粘稠度的半流动状液体。精液的颜色,难以作出确切的判断。一般认为,正常人刚射出的精液有强烈刺激的其味为石榴花的腥味,呈灰白或灰黄色,自行液化后则为半透明的乳白色或灰黄色。长时间未排精者射出的精液可略带淡黄色。老年男性精液呈暗黄色。精液量的主要组成部分是附属性腺的分泌物。

正常人一次排出的精液量约 2-5ml,平均为 2.4±1.3ml,但精液量与射精频数有关。一定的精液量是保证精子活动的间质,并可中和阴道的酸性分泌物,保护精子的生命力,以利于精子通过子宫颈口。少于 1.5ml、大于 8.0ml 可视为异常。刚射出的精液呈稠厚的胶冻状,在前列腺分泌的蛋白酶的作用下,5min 后从凝固状态转变成流动状液体的过程,称之为精液液化。

精液的暂时凝固及随后的液化属正常生理现象,与精襄腺分泌的凝固蛋白及前列腺分泌的液化因子有关。

观察液化时间,标本应放在 37℃,每 10min 观察 1 次。正常人刚排出的精液有高度的粘稠性,镜下观察精子呈不活动状态。精液离体后 5-10min 开始液化,20-40min 完全液化,液化后可看到具有完全正常活力的精子。

精液粘稠度测定对评价精浆质量提供了一个客观依据。粘稠度增高的临床意义与精液液化异常相同,并可反映前列腺因慢性炎症所造成的功能障碍。
精液的 pH 值由来自前列腺的酸性分泌物及精襄的碱性分泌决定,正常范围为 7.2-8.0。精液 pH 值>8.0,常见于急性感染,应怀疑前列腺因炎症而导致酸分泌物的减少,如枸橼酸;精液 pH 值<7.0,多见于少精或无精症,常反映输精管道阻塞、先天性精囊发育不全或附睾病变。注意,在精液标本采集不完全的情况下,也应当完整地记录精液的 pH 值。

②精子密度/浓度及精子总数

精子密度:是指每毫升精液中的精子数目,也称精子计数和精子浓度。
精子总数:是表示一次排精全部射出精液量中的精子总数目,即精子密度(106/ml)与精液量(ml)的乘积。

由于正常人精子有较高的密度、活动度及精液有较强的粘稠性,计数前应进行适当的稀释,并杀死或抑制精子活动和降低精液的粘稠性。

80 年代以前常采用计算血液白细胞方法,使用标准血细胞计数器来检验。
将精液标本充分混匀后,按 1:20 比例稀释后,滴入血细胞计数盘内,于室温中静置 2-5min,使精子完全沉积,然后以高倍镜计数中央大方格内 5 个中方格的精子数,计数原则为“数上不数下,数左不数右”。5 个中方格的精子数乘以 106 即为每 ml 精液中的精子数。

现在常采用 Makler 精子计数板、Microcell 精子计数池、计算机辅助精液分析(CASA)、精子质量分析仪(SQA)、精子图像分析仪等检测。精子总数可反映体内精子生成状态,并与禁欲时间长短有关。正常人精液精子密度变化很大。

WHO 规定:精子密度致孕的低限为 20×109/L,一次排精总数少于 1×108 ( l 亿)/L 为不正常。目前公认,精子密度低于 20×109/L 为不正常。连续 3 次检查皆低下者可确定为少精症。精液中多次未查到精子为无精子症,主要见于睾丸生精功能低下,先天性输精管、精囊缺陷或输精管阻塞。但必须强调的是:精子数 20×109/L 的患者并非无生育力,有些的受孕需要较长时间而已。精索静脉曲张、铅等重金属有害工业污染、大剂量放射线及某些药物,均可引起精子减少。正常人从 50 岁开始精子数减少,以至逐步消失。

③精子活力与活率

精子活力:是指活动精子的运动能力。是测定精子活动能力的定性方法。
精子活率:是指精子总数中活精子所占比例。是测定活精子和死精子的定量方法。
精子活力与活率取决于有鞭毛运动精子的百分率。该检验要在射精后 2 小时内进行,精液标本应保持在 37℃。从完全液化并充分混匀的精液标本中取一滴(小于 10ul)新鲜精液滴于干净、标准的载玻片或专用于精液分析的计数板上,盖上盖玻片,室温(18-24℃)静置 lmin,在低倍显微镜下随机选择 10 个视野,观察精子活动状态,计算活动精子百分率。

应当注意,检测用的精液量及盖玻片大小应当标准化,以保证分析时精液量的一致性(如 20ul)。盖玻片至玻片的高度应当使精子具有可充分旋转运动的空间。精子活力可受时间、温度、精液液化程度等的影响。因此,应当控制好室温,当温度范围超过 18-20℃时,精子动力会有部分改变,因此,实验室的室温应当标准化。

精子的前向运动是其质量评估的关键。WHO(1994)将精液的活力分为 4 个等级,国内习惯分为 5 个等级。

精子的运动级别(WHO):
A 级:快速直线前向运动
B 级:慢速或无定向运动
C 级:非前向运动
D 级:不运动

精子运动级别(国内)
0 级: 不活动,无向前运动
I 级: 活动不良,向前运动微弱,不呈直线运动,也不活泼
Ⅱ级:活动一般,有中等的向前运动
Ⅲ级:较好,有中速运动,但波形运动的较多
Ⅳ级:良好,为快速直线运动,很快超越一个视野,运动活泼

精子活力检验除了显微镜检查外,还有连续摄影法和精子质量分析仪测定法。在用上述方法评价精子活率时,检测结果易受多种因素影响,如将在精液中不动的精子均判定为死精子。现主要采用精子体外活体染色技术定量测定精子活率。

精子体外活体染色原理在于,精子染色与否与精子膜的损伤程度有关,死精子因其头部膜受损,色液可以渗透到细胞内而使细胞着色,而活精子则有完整的细胞膜,染色液不易渗入,精子不着色。

常用的精子体外活华体染色技术主要有伊红 Y 或胎盼蓝法和苯胺黑伊红法。
如果 0 级和 I 级精子在 40%以上,常为男性不育症的原因之一。

精索静脉曲张者由于静脉回流不畅造成阴囊内温度过高和睾丸组织缺氧,可使精子活力降低。

泌尿生殖系统的非特异性感染,如大肠埃希菌感染,以及某些抗代谢药、抗癌药、雌激素、氧化氮芥等,都可使精子活力下降。

④精子形态

精子形态的检测对精母细胞和生育力是一个敏感的指标。

正常形态精子似蝌蚪状,由头、体、尾三部分构成。
头部:略扁,呈卵圆形,顶体区清晰规则,占精子头部 40-70%,在精子头部前端呈透亮区;
体部:细长,不到头宽的 l/3,轮廓直而规则,与头纵轴成一直线;
尾部:细长,外观规则而不卷曲,一般长 50~60um。
胞浆小滴:是精子的残存体,大小不超过精子头部 1/3,与头部相连。

一些形态粗大的畸形精子在未染色的精液中通过亮视野显微镜检查就能明确。随着相差显微镜的使用,通过载玻片上湿的精液标本就可以获得细致的精子形态学检查。但是,最准确的检查需要将精液标本染色后显微镜观察。当精子计数<10×106/ml 时,应将精液 500rpm 离心 10min,取沉淀涂片;精子数>10×106/ml 时,直接取 l 滴精液涂片,空气中自然干燥。

精液涂片染色方法很多,巴氏染色法是男科实验室中最常用的精子染色方法。其它常用的有 HE(苏木精-伊红)染色法或瑞-姬氏染色法,形态的特殊鉴别可用改良巴氏染色法,白细胞与生精细胞的鉴别可使用 WHO 推荐的正甲苯胺蓝过氧化物酶染色法。

精子异常形态种类较多,但缺乏统一分类标准。
正常精液中异常形态精子 10-15%,>20%为异常。
精子畸变可出现在精子产生和附睾贮存过程中。
未成熟精子增多与附睾功能障碍有关,或频繁射精也可造成。
异常精子的形态常与感染、外伤、雄激素变化或化学药物及遗传因素影响有关。
生殖系统的非特异性感染,可导致尖头和不定形头精子比例增多。

精索静脉曲张由于静脉回流不畅造成阴囊内温度过高和睾丸组织缺氧,可引起精子头部或体部肿胀或缺陷,以及双头精子、胞浆小滴精子、卷尾精子的增多。

服用激素或某些化学药品,精液中会出现不成熟的精子及其他生殖细胞和精子细胞体的胞质小滴。

2.精子功能指标分析

传统的精液分析检查主要包括精子密度、活力与活率、形态学指标,在一定程度上反映了男性的生育能力。但有时精液常规分析的结果的结果与实际生育力之间不尽一致。临床上常发现一些不育病人上述指标是正常的(排除女方因素),但妻子不能怀孕。而精液常规分析精子密度低下者其妻子仍可怀孕。

研究表明,精液常规分析与实际生育力的一致性仅有 70%。精子功能指标的测定,更能客观地反映精子的受精能力,是对精液常规分析的必要补充。

精子功能测定主要有:
①精子运动功能指标的测定;
②精子穿卵试验;
③精子-宫颈粘液的相互作用;
④精子膜功能测定;
⑤精子核功能测定;
⑥精子线粒体功能测定;
⑦精子顶体反应和顶体酶活力测定等。

⑴精子活力的测定及其运动特征的分析

精子活动能力是精子受精的重要指标,因此,客观而准确地分析精子活力在男性不育的临床诊断中占有极为重要的地位。

在我国,目前临床上仍推荐由训练有素的检验人员严格按照 WHO 编辑的《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》进行精子活力及活力的测定。

但这些测定往往带有一定的主观性、重复性差等不足。目前,已发展了一系列客观评价人类精子活力及其运动特征的新技术,如采用浊度分析法、激光散射测量仪、显微摄像术、连续分步曝光照相术、计算机辅助的精液分析(CASA)技术等。

其中,以 CASA 技术受到普遍重视,它可以达到客观准确地量化分析精子运动轨迹,获得精子运动的多项参数。然而 CASA 系统受诸多因素影响,如测定精子浓度的准确性受精液中细胞成分和非精子的颗粒物质的干扰,测定活动精子百分率也受精液中非精子物质的干扰,以及由于不同厂家不同类型的 CASA 系统参数设置的差异而使彼此的检测结果无相比性,加上 CASA 所反映的是单个精子的运动参数,缺乏对精子群体的了解。

因此,当前(1992)仍推荐以直接目测法来判断精子群体活力及其活动精子百分率,使用血球计数器来测定精子数。

⑵精子-宫颈粘液相互作用测定

宫颈粘液是精子在受精过程中需穿越的第一道屏障。只有月经中期妇女的宫颈粘液才适合于精子的穿透。影响精子穿透宫颈粘液的因素包括宫颈粘液的理化状态、精浆酶的活性及精子运动的质量。

精子和宫颈粘液相互作用试验分体内试验和体外试验。

体内试验即性交后试验(PCT):
体外试验主要包括玻片试验、毛细管试验和精子-宫颈粘液接触试验。PCT 结果取决于精子与宫颈粘液的相互作用,任何一方的异常均可影响 PCR 结果。因此,PCT 不仅能测定宫颈粘液中的活精子的数量,也可以了解性交后一定时间内精子在女性体内存活和运动情况。毛细管试验操作简便,实验条件易控制,影响因素少,特别是可以作用供者的宫颈粘液或宫颈粘液代用品,可方便地同时检测一批标本。

此外,该试验还可以用来鉴别导致 PCT 结果异常的因素是在男方还是女方,具有很大的临床实用价值。影响毛细管试验的主要因素包括精子质量(精子活动力、形态正常精子百分率)、宫颈粘液的性状、试验时的温度、穿透时间及毛细管放置的位置。

玻片试验的原理和作用类似毛细管穿透试验,区别在于此法在载玻片上直接观察精子对宫颈粘液的穿透,比毛细管法更为简便。

⑶精子顶体反应和顶体酶活力测定

人类精子在离开男性生殖道时,还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程,才能获得受精能力,这一生理现象称为精子获能。
人类精子顶体位于精子头前端,覆盖在精子核前面,由顶体帽和赤道板组成,是一个膜结合的帽状结构。

顶体内含有多种蛋白水解酶和磷酸脂酶。获能的精子穿过卵丘细胞外基质时被激活引发顶体反应(AR)将顶体内的酶释放出来以溶解卵放射冠及透明带。精子只有在体内经过获能、顶体反应,才能穿入卵细胞与其融合,完成受精。因此,检测精子是否发生顶体反应有助于预测精子的受精能力。

精子顶体酶:是一种特殊的丝氨酸水解蛋白酶,它在引起精子顶体反应、精卵特异性结合、使精子穿过透明带等受精过程中起着关键作用。目前,对顶体酶在受精生物学和男性不育中的诊断价值越来越引起人们的重视。

检测精子顶体酶的试验主要有凝集素免疫荧光染色法及考马斯亮蓝染色法。
前者的检测原理主要是利用钙离子载体 A23187 诱导精子发生顶体反应,
然后用能与精子顶体中含有的大量糖蛋白的糖基结合的豌豆凝集素(PSA)作为探针检测精子顶体反应。

后者的检测原理也是利用钙离子载体 A23187 诱导精子发生顶体反应,发生顶体反应后的精子顶体丢失,顶体区不着色,顶体完整而被考马斯亮蓝染上紫蓝色的精子则为没有发生顶体反应的精子。

精子顶体酶活力的测定可直接用明胶法测定精子顶体酶活性,其检测原理是精子在明胶制成的薄膜上孵育后,引起顶体的解聚,释放出顶体酶,将明胶溶解成亮环,酶活性的大小可依据亮环直径大小来判断。

此外,顶体酶的活性还可通过检测酶活性可反映顶体酶全部活性的存在于精子顶体的精氨酸酰胺酶来确定。其原理是精氨酸酰胺酶以 Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺(BAPNA)为底物,分解产生有色产物–硝酰基苯胺,通过测定硝酰基苯胺的产量可推算出精氨酸酰胺酶的活性,从而反映顶体酶的全部活性。

⑷精卵相互作用的测定

精卵细胞相互作用的评估是评价人类精子受精力最重要、最可信的方法。
临床上应用最广泛的精卵相互作用的试验是精子穿去透明带金黄仓鼠卵试验(SPA),简称精子穿卵试验。

SPA 是测定精子获能、顶体反应、卵膜融合能力以及精子核解聚能力的经典方法,国外已将其作为精子功能的常规检测方法。但由于此实验条件要求高,操作步骤多,技术要求高,国内仅限于研究机构用于研究目的,临床未作常规展开。

在临床实践中,SPA 可用于以下几个方面:

①对原因不明的不育者,检测其精子的功能;
②在女方进行强有力的治疗,如促性腺激素治疗和输卵管成形术前,确定其丈夫精子的受精能力;
③估计不育症病人精液异常程度的严重程度、观察治疗效果;
④IVF-ET 时,估计供精者精液标本的质量和作受孕率的估计;
⑤检测生殖抗体,如抗精子抗体对生殖的影响;
⑥输精管结扎前,男性受精能力监测;
⑦评价化疗或放疗对男性肿瘤病人生育力的影响;
⑧估计化学药品、环境中的毒物和药物对人精子受精能力的影响。

⑸精子膜功能的测定

在精子功能检测中,精子膜功能试验也引起人们的关注。精子膜上含有丰富的多聚不饱和脂肪酸及多种蛋白成分,精子膜的功能与精子获能、顶体反应及精卵融合密切相关。

精子膜功能的测定,可预测精子的受精能力。

反映精子膜结构完整性,常采用活体染色法(台盼兰或伊红 Y,死精子染色,活精子不染色);而反映精子膜生理功能的完整性则采用精子尾部低渗肿胀试验(HOST)。

其主要检测原理为:精子在低渗溶液中,必须重新建立内外液体间的平衡,
水分子通过精子膜进入精子,使其精子体积增大而膨胀,这是活精子膜功能正常的标志,而膜功能不全(包括死精子)的精子表现为不膨胀。

目前,对 HOST 的临床价值仍有争议,对是否能预测精子的受精能力有不同的看法,尚需积累更多的资料。

⑹精子核功能的测定

精子核:是精子重要的细胞器,包涵了父方的遗传物质。
精子发生过程中,各期生精细胞核内 DNA 的含量发生规律性变化,与核 DNA 结合的核蛋白也发生组型转换(即从组蛋白→过度蛋白→鱼精蛋白)。成熟的精子核内 DNA 与鱼精蛋白紧密结合,高度浓缩,抑制了基因的表达,使遗传物质保持稳定。精子核成熟度直接影响精子的受精能力和受精后原核的形成及胚胎的着床。

目前,检测精子核功能的主要试验有:

a,精子核 DNA 荧光染色、
b,精子核染色质抗解聚试验、
c,苯胺蓝染色法检测精子核蛋白组型转换、
d,精子核蛋白组分的测定等。

⑺精子线粒体功能的测定

精子线粒体位于精子尾部的中段,形成线粒体鞘结构。哺乳类动物每个精子约含有 75 个线粒体。线粒体是精子运动能量提供的场所。线粒体鞘局部或完全缺失、线粒体的体积及分布异常,都可能使精子运动能力发生障碍而导致不育。在弱精子症和死精子症中,可见大量线粒体缺陷的存在。

目前,检测线粒体功能的试验主要有硝基四氮唑蓝(NBT)法测定线粒体功能及精子线粒体 DNA 的测定。

血清抗精子抗体对 IVF 结局的影响

同种抗精子抗体可以干扰精子运行、精卵相互作用而引起不孕。过去对此类患者多采用避孕套、免疫抑制剂以及宫腔内人工授精等方法治疗,但疗效不佳,近年来采用 IVF-ET 技术治疗此类不孕患者。

目前,对女性血清抗精子抗体与 IVF-ET 结局的关系观点不一,多数学者认为在 IVF-ET 治疗中,采用供者血清或脐带血清体外培养体系,则可使此抗体阳性患者 IVF-ET 结局不受影响。

本研究表明,尽管采取供者血清体外培养体系,抗精子抗体阳性组其受精卵在体外的卵裂率明显低于抗体阴性组,说明体外培养体系中可能存在抗精子抗体,干扰了受精卵的早期发育,其机理可能是抗精子抗体同时存在于卵泡液、卵丘和放射冠的颗粒细胞上,使受精卵在体外的早期发育受到不利影响。

胚胎移植后,血清抗精子抗体对胚胎的着床率、临床妊娠率有无影响,报道不一致。动物实验发现,在早期胚胎表面存在精子抗原,引起母体免疫反应,而干扰胚胎早期发育。在人类也有血清抗精子抗体与习惯性流产相关的报道。

本研究发现,抗精子抗体阳性组的临床妊娠率不低于抗体阴性组,两组的流产率相近,说明,抗精子抗体对 IVF-ET 中胚胎着床、以及胚胎着床后在宫腔的早期发育无不良影响,此结果与 Daiton 等的报道相似。有关抗精子抗体对 IVF-ET 结局的影响机理,仍需进一步研究。

女性血清抗精子抗体对 IVF-ET 胚胎着床率与临床妊娠率均无影响,采取 IVF-ET 技术是治疗抗精子抗体引起的免疫不孕的有效手段,对此类患者行 IVF-ET 治疗时应采取供者血清体外培养体系,提高卵细胞体外受精及发育的质量,从而提高其临床妊娠率。



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